O diagnóstico de certeza de um processo infeccioso é a demonstração do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro. Porém nem sempre isso é possível, quer pela ausência do agente infeccioso, quer pela falta de sensibilidade dos métodos utilizados, ou por falhas técnicas ou pelos longos períodos exigidos para uma resposta do laboratório. Os métodos imunológicos diretos ou indiretos têm sido amplamente utilizados para suprir as deficiências dos métodos parasitológicos ou microbiológicos na pesquisa de antígenos, anticorpos ou imunocomplexos, pela rapidez, simplicidade de execução, possibilidade de automação e baixo custo operacional. O conhecimento da aplicação dos testes sorológicos e a interpretação correta dos resultados obtidos são fundamentais para clínicos, patologistas e laboratoristas orientarem seu trabalho visando o diagnóstico correto, associando sempre os resultados obtidos às investigações clínicas e epidemiológicas.
Na pesquisa de anticorpos, os testes sorológicos têm sido utilizados com sucesso como auxiliares importantes no diagnóstico individual ou em inquéritos soroepidemiológicos, devido às suas múltiplas possibilidades de emprego.
PRECIPITAÇÃO
As técnicas de imunoprecipitação, baseadas na quantificação de precipitados formados pela reação antígeno-anticorpo, começaram em 1897, Rudolf Kraus, em Viena, ralatou a precipitação que ocorria pela interação de antígenos solúveis e seus anti-soros correspondentes e, em 1905, Bechhold, na Alemanha, apresentou seus experimentos sobre imunoprecipitados em géis.
A quantidade de precipitado formado quando, a uma concentração constante de anticorpo, se vai adicionando antígeno é caracterizada por uma curva parabólica, descrita por Heidelberger e Kendall em 1935. Essa quantidade de precipitado depende de vários fatores físico-químicos e imunológicos, mas principalmente das concentrações relativas do antígeno e do anticorpo. Quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, a precipitação é máxima, decrescendo quando há excesso de antígeno ou de anticorpo. Precipitados já formados podem se dissolver quando expostos a um excesso de um dos reagentes, devido à reversibilidade da ligação antígeno-anticorpo. O fenômeno de prozona ocorre quando há um excesso de anticorpo e pode causar um erro de interpretação dos resultados, sendo necessário que se faça uma titulação do anticorpo com quantidades fixas de antígeno, para evitar tais erros.
Imunodifusão
A difusão de uma substância solúvel em um meio fluido é um processo pelo qual a substância é transportada, de uma parte para outra, como resultado do movimento molecular ao acaso. A difusão pode ser efetuada em meio gelificado, que impede a formação de correntes, por diferenças de temperatura. Se os poros do gel são consideravelmente maiores do que o tamanho das partículas, a difusão se realiza em meio fluido. Quando os imunoprecipitados são formados no gel ágar, o tamanho dos agregados fica maior do que o diâmetro dos poros e evita-se a difusão dos complexos de antígeno-anticorpo. As técnicas de imunodifusão detectam a reação antígeno-anticorpo através da formação de um precipitado.
A imunodifusão pode ser simples ou dupla. Na imunodifusão simples, ou o antígeno ou o anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se difunde, até haver a precipitação do complexo. Na imunodifusão dupla, tanto o antígeno como o anticorpo se movem, um me direção ao outro, até haver a precipitação. Em ambos os casos, a difusão pode ser linear (unidimensional) ou radial (bidimensional).
- Imunodifusão Simples em uma dimensão
O método de Oudin para a análise qualitativa e quantitativa dos sistemas de precipitação baseia-se na difusão simples em uma dimensão. Nesta técnica, o anti-soro é incorporado ao ágar, sendo essa mistura colocada em um tubo até formar uma coluna de 35-45 mm de altura. Após a gelificação, o antígeno é colocado no topo da coluna. Os tubos são selados, para evitar evaporação, e deixados a uma temperatura constante durante o período de observação, que é, em geral, de uma semana. A fim de induzir a difusão do reagente externo no gel, sua concentração deve ser bem maior do que a do reagente contido no gel.
- Imunodifusão Radial Simples
Mancini introduziu uma técnica de difusão simples para a determinação quantitativa de antígenos. Neste método, o ágar é misturado com a diluição apropriada do anticorpo específico para determinado antígeno e a mistura é colocada em placa de Petri ou lâmina de vidro. Em locais apropriados do gel são feitos orifícios em que se colocam volumes preciosos das soluções de antígeno a serem testadas, bem como soluções-padrão com pelo menos três concentrações conhecidas do antígeno. O suporte é incubado em câmara úmida até que ocorra a difusão (48 a 72 horas), sendo então determinada área do halo de precipitação formado. Para uma dada concentração de anticorpo, a área do halo formado, ao término da difusão é diretamente proporcional à concentração do antígeno. A sensibilidade do teste pode variar com a concentração do anti-soro. Uma concentração baixa de anti-soro aumenta a sensibilidade, mas não permite a medida de concentrações de antígeno em excesso. Por outro lado, uma alta concentração de anti-soro diminui a sensibilidade, mas permite a quantificação de concentrações maiores de antígeno.
Pelo método de Fahey, os halos de precipitação podem ser medidos antes do término da difusão e, neste caso, o logaritmo da concentração do antígeno é proporcional ao diâmetro do halo. Empregando-se antígenos-padrão diluídos em série é possível construir curvas-padrão, e as equações que descrevem tais curvas podem ser utilizadas para a determinação da concentração de antígeno correspondente a qualquer diâmetro. A sensibilidade destes métodos varia de 1 a 3 µg/ml de antígeno. Uma importante aplicação desta técnica é a quantificação das concentrações de imunoglobulinas séricas.
- Dupla Imunodifusão de Ouchterlony
O método baseia-se na precipitação que ocorre na região de equivalência quando o antígeno e o anticorpo se difundem no ágar. O complexo antígeno-anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arco de precipitação. A velocidade de difusão de cada substância é regida pelas leis da difusão e depende da concentração e do tamanho da molécula, do tamanho dos poros do gel, da temperatura, da concentração do ágar e de sua pureza.
O teste é realizado colocando-se uma camada de ágar em lâminas de vidro ou placas de Petri previamente recobertas com uma fina camada de ágar. Após a gelificação, são feitos orifícios no ágar, de acordo com o sistema a ser analisado. As soluções contendo o antígeno e o anticorpo são colocadas nos orifícios do ágar, as placas ou lâminas são incubadas em câmara úmida com vedação a uma temperatura conveniente e constante por 18 a 24 horas.
Cada linha em um espectro de precipitação corresponde a um par de antígeno-anticorpo. A ausência do antígeno ou do anticorpo é indicada pela ausência da linha. Cada precipitado funciona como uma barreira para os reagentes que o formam e impede sua difusão além do sítio da precipitação. Essa barreira é imunoespecífica e a difusão de outros reagentes não é impedida, a menos que a densidade dos agregados provoque um obstáculo mecânico.
O método de Ouchterlony permite a comparação de vários sistemas antigênicos, desde que colocamos em orifícios adjacentes contra um mesmo sistema de anticorpos, formando vários padrões que indicam a existência, ou não, de determinantes antigênicos comuns. As linhas formadas podem ser completamente coalescentes, no caso de antígenos com os mesmos determinantes (identidade imunológica); podem apresentar um “esporão”, como no caso de antígenos parcialmente relacionados (identidade parcial); ou podem formar uma interseção, indicando a ausência de relação entre os antígenos (não-identidade). Quando os reagentes estão em quantidades balanceadas, a linha de precipitação formada terá a curvatura voltada para o orifício que contém a substância de maior peso molecular, que se difunde mais lentamente.
O método pode ser utilizado para avaliações semiquantitativas quando se conhece a especificidade das linhas de precipitação, como, por exemplo, na titulação de antígenos ou de anticorpos. Podem-se caracterizar antígenos de vários agentes infecciosos empregando-se anticorpos de especificidade e reatividade conhecidas. A formação de uma única linha de precipitação dá indícios da pureza do antígeno ou do anticorpo, porém de um modo muito preciso.
O método apresenta várias limitações pois requer 18 a 24 horas de difusão para que a reação se processe, não sendo útil em casos em que se necessita de um método rápido de diagnóstico. Ao mesmo tempo, apresenta uma sensibilidade baixa e limita-se à detecção de reações antígeno-anticorpo em que há formação de precipitados.
Eletroimunodifusão
Nas técnicas de imunodifusão, o antígeno e o anticorpo entram em contato e precipitam no ágar por um processo de difusão. Porém, a velocidade de precipitação pode ser muito aumentada se a migração for dirigida por um campo elétrico, como no caso da eletroimunodifusão. Está técnica tem sido empregada na detecção de antígeno.
- Eletroimunodifusão Dupla Unidimensional
O princípio básico do método é a eletroforese do antígeno e do anticorpo simultaneamente, que migram em direções opostas a partir dos orifícios separados do gel, resultando na precipitação em um ponto intermediário entre as suas origens.
Este método requer que o antígeno e o anticorpo em teste apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas. O pH do tampão deve ser escolhido a fim de otimizar os efeitos eletroendosmóticos do anticorpo para o catodo (pólo negativo), enquanto o antígeno se move em direção do anodo (pólo positivo).
- Eletroimunodifusão Simples Unidimensional
Nesta técnica, o anti-soro específico para o antígeno ou antígenos que se quer quantificar é incorporado ao gel, que é colocado em lâmina de vidro numa posição fixa de modo que o anticorpo não migre. O material contendo o antígeno é colocado em um pequeno orifício e é submetido a uma eletroforese. O padrão de imunoprecipitação resultante se assemelha a um foguete. Esse padrão ocorre porque a precipitação se forma nas margens laterais dos limites do antígeno vai precipitando, sua concentração diminui, e as margens laterais convergem para uma ponta. A distância total de migração do antígeno para uma dada concentração de anti-soro é linearmente proporcional à concentração do antígeno.
AGLUTINAÇÃO
A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície.
A aglutinação pode ocorrer tanto com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) como com partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, bentonita, etc.), ou mesmo com células antigenicamente não relacionadas (hemácias, bactérias) às quais se adsorvem ou se fixam antígenos solúveis. No primeiro caso, a reação é dita aglutinação direta, e no segundo, aglutinação indireta ou passiva.
As reações de aglutinação são muito empregadas para o diagnóstico laboratorial de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos, doenças auto-imunes, na detecção de hormânios, na tipagem de grupos sanguíneos dos sistemas ABO e Rh, etc.
Os testes de aglutinação podem ser realizados em tubos ou placas. Se o soro possuir um elevado título de anticorpos aglutinantes, pode-se observar o fenômeno de prozona, obtendo-se falsos resultados negativos. Esse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro.
Teste de Aglutinação Direta
Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada. Hemácias, bactérias, fungos, protozoários podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados empregando-se diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antígeno. Após um período de incubação, a aglutinação se completa e o resultado é geralmente expresso como o título do anti-soro, isto é, a máxima diluição em que ocorre a aglutinação.
- Teste de Inibição de Hemaglutinação Direta
A inibição da hemaglutinação direta é baseada na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partículas virais, resultando na inibição da aglutinação, indicando um teste positivo para a presença de anticorpos. Estes testes não distinguem entre IgG e IgM. Este método é usado para detectar anticorpos contra o vírus da rubéola, sarampo, influenza e certos enterovírus.
Teste de Aglutinação Passiva ou indireta
Para o teste de aglutinação passiva, as hemácias e as partículas inertes (látex, bentonita, “sepharose”, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto com os antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos, como ácido tânico, cloreto de cromo e por conjugação do antígeno, por meio de ligações químicas covalentes, fornecendo reagentes estáveis. Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células ou partículas, a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito variada.
- Teste de Hemaglutinação Passiva
A verificação de Boyden, em 1951, de que proteínas podiam ser adsorvidas a hemácias tratadas com ácido tânico e que essas células podiam ser aglutinadas por anticorpos específicos possibilitou o emprego dos métodos de aglutinação para a detecção de anticorpos contra várias substâncias.
Hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação, pois há uma série de antígenos que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de anticorpos. Além disso, os testes em placa permitem que a determinação do ponto final da reação seja feita diretamente. Hemácias possuem uma superfície complexa, o que facilita a ligação de muitos antígenos e, freqüentemente, acarreta a presença de anticorpos heterófilos no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execução do teste.
Antígenos polissacarídeos prontamente aderem a hemácias, enquanto antígenos protéicos requerem pré-tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo.
O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e é considerado positivo quando se verifica a formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V”, e negativo quando as hemácias sedimentam formando um “botão” compacto. O título da amostra testada será a máxima diluição em que ainda se observa a formação do tapete.
O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinação que os IgG, a quantidade de antígeno necessária para se obter a máxima reatividade com IgM é muito maior do que a necessária para a máxima reatividade com IgG. Empregando-se hemácias sensibilizadas com antígenos protéicos, quando adequadamente padronizado, o teste detecta anticorpos em níveis de concentração de 0,01 µg/ml. Há vários sistemas comerciais para a pesquisa de anticorpos que utilizam esta técnica, entre eles, os sistemas de Trypanossoma cruzi, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, etc.
- Teste de Inibição de Hemaglutinação Passiva
O teste de inibição de hemaglutinação passiva é sensível e específico na detecção de pequenas quantidades de antígenos solúveis, haptenos ou anticorpos que competem com a substância homóloga com que a hemácia foi sensibilizada.
O princípio do teste baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do anticorpo, entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o hapteno. O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do antígeno presente na amostra e, também com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo.
Este método requer pequenas quantidades de reagentes, detecta antígeno na ordem de 0,1 a 10 µg/ml, apresenta especificidade elevada e pode ser empregado em sistemas em que antígenos solúveis ainda não foram obtidos. Tem sido empregado na detecção de antígeno na hepatite e na hemofilia.
- Teste de Aglutinação do Látex
Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação antígeno-anticorpo.
O teste pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. A aplicação mais comum é na detecção do fator reumatóide , que é anticorpo da classe IgM pentamérico dirigido contra IgG. Adsorvendo IgG passivamente ás partículas do látex, haverá a exposição dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatóide, resultando em aglutinação. Este método é mais sensível e menos específico que a hemaglutinação passiva para a detecção de fator reumatóide. O fator reumatóide deve ser um auto-anticorpo à porção Fc de IgG agregada ou alterada, ocorrendo doenças auto-imunes, em processo agudos ou crônicos, em doenças reumáticas, em doenças infecciosas, degenerativas, etc..Também é empregada na pesquisa da proteína C que aparece no soro de pacientes na fase aguda de várias infecções, como estafilocócica ou estreptocócica, febre reumática, etc.
ENSAIOS LÍTICOS
Teste de Fixação do Complemento
A ligação antígeno-anticorpo promove a fiação do complemento, cujo consumo, invitro, pode ser empregado para detectar a presença de anticorpos, antígenos ou ambos.
O teste utiliza um sistema homogêneo (não é preciso a separação entre fases) e é realizado em duas etapas. Na primeira etapa, o antígeno é incubado, na fase fluida, na presença de uma quantidade definida de complemento. Se o antígeno e o anticorpo correspondentes estiverem presentes, a cascata do complemento será ativada pela via clássica e haverá consumo de complemento. Na segunda etapa, adiciona-se o sistema indicador da reação que consiste em hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo anti-hemácias de carneiro obtido em coelhos). A medida da atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite determinar a presença ou não de antígeno ou anticorpo na mistura inicial e sua quantidade. A atividade hemolítica remanescente pode ser quantificada empregando-se diluições seriadas da amostra a ser analisada. Tanto o anticorpo como o antígeno devem ser destituídos de ação anticomplementar, ou seja, não podem ativar o complemento separadamente. O complemento deve ser obtido de soro de cobaia e colhido e estocado de maneira apropriada para preservação da atividade hemolítica. Anticorpos humanos IgM, IgG1, IgG2 e IgG3 fixam complemento pela via direta, enquanto o IgA fixa complemento pela via alternativa.
O teste pode ser qualitativo ou quantitativo. O método qualitativo baseia-se na titulação do complemento residual que não foi consumido pela reação antígeno-anticorpo com o sistema indicador. Esse método, embora sensível, é muito laborioso para fins diagnósticos. O método quantitativo possui muitas variações técnicas, entre as quais o micrométodo, que permite revelar quantidades mínimas de complemento fixado.
Atualmente, embora haja testes bem mais sensíveis, ainda é utilizado na sorologia da doença de Chagas, da sífilis e de vários vírus, rickettsias e fungos. Apresenta a vantagem de poder ser empregado para diferentes sistemas sem mudar os parâmetros do teste, porém é complexo e trabalhoso.
TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
O teste de imunofluorescência é um dos mais utilizados no diagnósticos de laboratório para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais com anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas. Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.
Teste de Imunofluorescência Direta
O teste de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o preparado é observado em microscópio de fluorescência.
O teste tem sido utilizado para a pesquisa de Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, estreptococos ß-hemolítico do grupo A e vários vírus, com os do herpes simples tipo 1 e 2, o citomegalovírus, os da influenza tipo A e B, os da parainfluenza 1,2 e 3, o da varicela-zoster e o adenovírus.
Teste de Imunofluorescência Indireta
A sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível de fluorescência detectável pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescência indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. Pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos.
· Para a Pesquisa de Antígenos
Consiste na incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando a formação de um imunocomplexo. Após a lavagem, a preparação é incubada com um conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espécie de animal.
· Para a Pesquisa de Anticorpos
Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. Após lavagens, a preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno.
TÉCNICAS COM MARCADORES RADIOATIVOS
Radioimunoensaio
O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas; mesmo em preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. Com limitações destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.
O radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra.
· Radioimunoensaio Direto
No radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não-marcado. Após um período de incubação, remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
· Radioimunoensaio de competição
No radioimunoensaio de competição, uma quantidade fixa do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação, o anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são removidos por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
· Radioimunoensaio de captura
No radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após a incubação, remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS
As técnicas imunoenzimáticas são baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substancias de interesse biológico.
Imunoperoxidase
As técnicas para localização de constituintes celulares seguem o mesmo princípio da imunofluorescência, com a diferença de que, em vez do fluorocromo, emprega-se a enzima, que tem maior capacidade de amplificação. A enzima converte o componente cromógeno (substrato+doador de hidrogênios) em produto insolúvel que precipita no sítio da reação. Esses precipitados podem ser visíveis ao microscópio eletrônico.
Enzimaimunoensaio
O enzimaimunoensaio é um método quantitativo em que a reação antígeno-anticorpo é monitorada por medida da atividade enzimática. Desempenha um papel muito importante no laboratório clínico, pois, além da elevada sensibilidade comparável à do radioimunoensaio, apresenta vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como à automação sofisticada.
Uma característica comum entre radioimunoensaio e enzimaimunoensaio é que ambos medem, diretamente, a interação entre o antígeno e o anticorpo, não dependendo de um segundo fenômeno como precipitação, aglutinação ou fixação de complemento.
O enzimaimunoensaio foi classificado em dois tipos: homogêneo e heterogêneo. Nos ensaios homogêneos não é necessária a separação entre os complexos antígeno-anticorpo e o antígeno e/ou o anticorpo livres, pois a interação antígeno-anticorpo modula a atividade da enzima. Nos ensaios heterogêneos, a separação é necessária, pois a atividade da enzima não é alterada pela reação antígeno-anticorpo. Os ensaios homogêneos são mais utilizados para a detecção de haptenos e os heterogêneos para a detecção de moléculas maiores.
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Esse teste foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a detecção de antígenos e anticorpos. O seu princípio básico é a imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo.
O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. Especial atenção deve ser dada a fase sólida, cujas propriedades podem variar de acordo com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo da fase sólida é muito importante, pois qualquer material heterólogo competirá pelo espaço na placa.
O objetivo do ensaio é a quantificação ou verificação da presença de um antígeno ou anticorpo
SLFIA (Substrate-Labelled Fluorescent Immunoassay)
Pode ser utilizado para detectar reagentes de alto e baixo peso molecular. Foi desenvolvido pela Ames Company of Miles Laboratories. No ensaio, um substrato fluorogênico da ß-galactosidase é ligado covalentemente a um antígeno protéico ou hapteno. Se o anticorpo específico reage com antígeno, a enzima ß-galactosidase não cliva o substrato, por impedimento estérico. Se a amostra tiver antígeno, este se ligará ao anticorpo e o substrato ligado ao antígeno ficará livre e reagirá com a enzima para formar o produto fluorescente. O grau de fluorescência é proporcional à quantidade de antígeno na amostra.
Bibliografia:
Ferreira, A. Watter; Ávila, Sandra L.M. Diagnóstico Laboratorial .1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ.
